Интеграция результатов сравнительной геномики позволяет нам начать строить карту всей «вселенной генов». Глобальная эволюционная устойчивость генов, проявляющаяся прежде всего в сохранении белковых и РНК-последовательностей, стала очевидной в результате самых первых сравнений секвенированных прокариотических и эукариотических геномов: бактерии Haemophilus influenzae и Mycoplasma genitalium, археи Methanocaldococcus jannaschii и эукариотических дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Tatusov et al., 1997). Ключевое обобщение сравнительной геномики состоит в том, что гены не просто сохраняются на различных интервалах эволюционного процесса, но и представляют собой дискретные единицы эволюции, а именно ортологичные эволюционные линии (см. табл. 3–1). В сегодняшней коллекции секвенированных геномов найдены ортологи в далеких таксонах для значительного большинства белок-кодирующих генов в каждом геноме. Ярким примером являются недавние результаты секвенирования генома примитивных животных: многочисленные гены Trichoplax и губки связаны ортологичными отношениями с генами млекопитающих и птиц (Putnam et al., 2007; Srivastava et al., 2008; Srivastava et al., 2010). Один из выводов состоит в том, что характерная продолжительность жизни животного гена в этих линиях охватывает по меньшей мере сотни миллионов лет. Многие другие группы животных, такие как насекомые, утеряли многочисленные гены (Koonin et al., 2004), так что судьба одного и того же гена в большинстве случаев отличается в разных линиях, в результате чего мы получаем «пятнистую» филетическую модель. (Как подчеркивается далее в этой главе, множество поистине универсальных генов чрезвычайно мало.) Судьбы конкретных генов в разных линиях зависят как от случайных факторов, так и от различий в давлении отбора (см. гл. 9). Результаты обширного сравнительного анализа геномов растений, грибов и прокариот полностью совместимы с этим выводом. Когда гены в геноме классифицируются по их относительному «возрасту» (то есть филогенетической глубине, на которой обнаруживаются гомологи), наблюдаемое расхождение подобно для удаленных друг от друга организмов, как показано на рис. 3–3 для генетических наборов человека и грибка Aspergillus fumigatus (Wolf et al., 2009), двух организмов, разделенных, по-видимому, миллиардами лет эволюции. Тем не менее распределения генных возрастов поразительно похожи: в каждом случае древних генов, для которых легко обнаруживаются гомологи в далеких таксонах, значительно больше, чем «молодых» генов. Несмотря на частую потерю в отдельных эволюционных линиях, гены характеризуются чрезвычайной долговечностью, и многие из них, возможно, бессмертны[34].

Как обсуждается далее в этой книге (гл. 5 и 7), пути передачи генетической информации у прокариот принципиально отличаются от таковых у эукариот. Тем не менее доли консервативных генов у них примерно равны. В настоящее время эта доля хорошо известна и очень близка у разнообразных бактерий и архей, почти как фундаментальная постоянная: для 70–80 процентов генов ортологи обнаруживаются в далеких организмах (Koonin and Wolf, 2008b; см. рис. 3–4).

Секвенирование геномов симбиотических и паразитических бактерий привело к соблазнительной идее, что их генетический репертуар может быть близок к «наименьшему возможному набору генов», то есть такому, который является необходимым и достаточным для поддержания простой (прокариотической) клетки при самых благоприятных условиях, какие только могут существовать вне других клеток (Fraser et al., 1995; Mushegian and Koonin, 1996b). Последнее условие чрезвычайно важно, поскольку «наименьшим возможным» набор генов будет лишь в отношении к окружающей среде, в которой соответствующий организм существует (или мог бы существовать, в случае «концептуальных» геномов, полученных компьютерными методами). Однако, как только появились первые два полных бактериальных генома, вторым из которых был геном Mycoplasma genitalium[35], лишенной клеточной стенки паразитической бактерии с размером генома всего около 570 генов, возникла очевидная идея, что «истинный» наименьший набор можно естественным образом вывести, сравнивая геномы этих двух существенно различно специализированных бактериальных патогенов (Mushegian and Koonin, 1996b). Точнее, можно было бы ожидать, что ортологичные гены в двух организмах будет представлять собой набор основных биологических функций, которые необходимы для выживания клетки, независимо от уникального образа жизни каждого организма.

Сравнение геномных наборов H. influenzae и M. genitalium дало 240 пар ортологичных генов, охватывающих большую часть очевидно существенных клеточных функций. Тем не менее в этом консервативном наборе несколько важных функций явно отсутствовали. До сих пор мы не говорили о «настоящей биологии», о биологических функциях, ролях генов, но теперь мы должны начать думать биологически. Определение минимального набора основных биологических функций – задача непростая. Соблазнительно, конечно, попытаться «разобрать эволюцию по винтику»: идя от сравнительной геномики, определить минимальный набор основных генов, сохраняемых во всех клеточных формах жизни. Но этот подход упускает возможность, что разные организмы могли прийти к решению одной и той же принципиальной задачи независимыми путями. Мы увидим далее в этой главе, что такая гипотетическая возможность действительно отражает важный аспект биологической реальности. Таким образом, чтобы очертить минимальный набор клеточных функций, нам необходимо обратиться к логике биохимии и клеточной биологии. Знаний в этих областях несомненно достаточно, чтобы составить разумный каталог основных функций. Само собой, это знание несовершенно, поэтому на самом деле вычисление минимального набора генов требует многократного поочередного обращения к биологическому обоснованию и сравнительному геномному анализу. Мы с Аркадием Мушегяном предположили, что принципиально важные функции, отсутствующие среди 240 ортологов H. influenzae и M. genitalium, вероятно, исполняются неродственными или отдаленно родственными белками в этих двух бактериях. Мы привлекли определенные догадки, чтобы увеличить предполагаемый минимальный набор на 16 дополнительных генов M. genitalium (см. рис. 3-10). Этот простое упражнение в получении минимального набора генов соединением сравнительной геномики и биологической логики оказалось достаточно успешным и, по-видимому, определило приближенный функциональный репертуар простейшей бактериальной клетки, способной к самостоятельному росту в наиболее благоприятных условиях. В самом деле, последующие эксперименты с нокаутом генов подтвердили, что большинство из генов, включенных в минимальный набор, необходимы для выживания бактерий и что гены из минимального набора присутствуют в большинстве (хотя и не обязательно во всех) вновь секвенированных бактериальных геномах (Delaye and Moya, 2010; Koonin, 2003).

Рис. 3-10. Выделение минимального набора генов клеточной жизни методами сравнительной геномики. G1, G2, G3 – три сравниваемых генома; С – набор консервативных генов.

Рис. 3-11. Распределение числа генов по биологическим функциям в минимальном генном наборе, полном наборе КОГ и среди экспериментально определенных незаменимых генов бактерии Bacillus subtilis. Данные по Koonin, 2003.

Поучительно провести теперь функциональную перепись минимального бактериального набора генов. В этом наборе преобладают гены, которые кодируют белки, участвующие в передаче информации в клетке (репликации, транскрипции и, прежде всего, трансляции). Метаболические ферменты и белки транспортной системы представлены куда более разреженно, что вполне ожидаемо для организма, растущего в самой богатой из возможных сред. Этим минимальный набор генов резко отличается от полного набора КОГ, но напоминает набор незаменимых бактериальных генов (нокаут которых убивает бактерию, см. рис. 3-11). Эта особая эволюционная устойчивость систем передачи клеточной информации является одним из центральных обобщений сравнительной геномики. Мы вернемся к этому вопросу позднее.

Рис. 3-12. Эволюционный сценарий замещения неортологичных генов.

По-видимому, самым весомым результатом поиска минимального набора генов было открытие, что в списке легко обнаружимых ортологов недостает нескольких важных функций. Этот результат был подтвержден и значительно усилен при сравнении бактериальных геномов с первым архейным (Methanocaldococcus jannaschii), когда в наборе консервативных необходимых функций выявилось несколько дополнительных зияющих пробелов. Эти выводы были обобщены в понятии замещения неортологичных генов (ЗНОГ), эволюционном сценарии, при котором неродственные или отдаленно родственные гены (иными словами, не ортологи) становятся ответственными за одни и те же необходимые функции в разных организмах (Koonin, 2003). Сам этот эволюционный сценарий легко представить (см. рис 3-12): чтобы произошло ЗНОГ, эволюционирующая линия приобретает альтернативный, функционально избыточный ген для некоторой незаменимой функции и таким образом проходит через промежуточное состояние, в котором присутствуют обе реализации данной функции (такая избыточность часто наблюдается у организмов с более сложными геномами), а затем теряет начальный ген (Koonin and Mushegian, 1996). С ростом коллекции секвенированных геномов обнаруживается все больше организмов, в которых оба варианта действительно представлены для разнообразных функций; таким образом, сценарий эволюции ЗНОГ, представленный на рис. 3-12, становится все более правдоподобным.

В табл. 3–2 описывается несколько примеров ключевых биологических функций, для которых два или несколько неродственных ферментов по-разному представлены в частично дополнительных, но обычно перекрывающихся группах эволюционных линий. Даже эти отдельные примеры показывают, что ЗНОГ происходит в самых различных функциональных системах и путях. В дальнейшем, с заметным увеличением числа секвенированных геномов, стало ясно, что ЗНОГ и утрата генов в отдельных линиях настолько широко распространены, что лишь малое число функций являются действительно мономорфными и вездесущими (то есть представлены ортологичными генами во всех организмах). Вместе с тем универсальное ядро жизни уменьшилось почти до исчезновения: все, что остается универсальным, – это около тридцати генов белков трансляции и три больших субъединицы РНК-полимеразы, а также примерно равное число генов структурных РНК (рРНК и тРНК).

Таблица 3–2. Примеры замещения неортологичных генов.

Даже при исключении паразитических бактерий перечень универсальных генов расширяется незначительно (Koonin, 2003). Таким образом, за исключением небольшого числа генов, участвующих в основных этапах передачи информации, не существует универсального генетического ядра жизни, в связи с повсеместными ЗНОГ и потерей генов. Концепция небольшого, универсального набора функций, необходимых для поддержания клетки, остается жизнеспособной, но, учитывая комбинаторику ЗНОГ, этот наименьший набор функциональных ниш может заполняться огромным разнообразием генных ансамблей.

Результаты сравнительной геномики приводят к ключевому обобщению, которое позволяет нам выполнять продуктивные эволюционные исследования: основные единицы эволюции могут быть довольно четко определены, и единицы эти – кластеры ортологичных генов, или эволюционные домены (КОГ), или, еще точнее, линии эволюционирующих ортологичных генов (доменов). Истории отдельных генов часто сложны (а во многих случаях даже чрезвычайно сложны) и включают в себя множественные утраты генов, дупликацию и горизонтальный перенос (ниже в настоящей книге мы обсудим эти явления подробнее, см. гл. 5 и 7). Предрасположенность генов к дупликации, утрате и переносу варьирует в широких пределах. Однако, невзирая на все эти осложнения, атомарное свойство наборов ортологичных генов твердо соблюдается: КОГ суть естественные элементы генетической вселенной.

Генетическая (геномная) вселенная (это только метафора, но удобная и, возможно, продуктивная) может быть представлена как развивающееся пространство-время, заполненное кластерами, состоящими из генов (то есть КОГ), или, точнее, эволюционирующими линиями ортологов, элементарными единицами эволюции. Ортология легче всего прослеживается между прокариотическими генами, так что здесь мы обсудим прокариотическую область геномной вселенной. Тенденции среди эукариотов в принципе похожи, но осложнены распространенной мультидоменной организацией белков и обширной паралогией. В нашем геномном пространстве заметно характерное распределение КОГ по геномам, хорошо аппроксимируемое тремя экспонентами с разными показателями, которые делят генную популяцию на три класса (см. рис. 3-13, а – в; Koonin and Wolf, 2008b).

1. (Почти) универсальные гены, те, что представлены в (почти) всех геномах клеточных форм жизни, составляют лишь малую часть генетической вселенной: это ядро клеточной жизни состоит, самое большее, из приблизительно 70 генов. В каждом конкретном геноме доля этих «ядерных» генов составляет не более 10 процентов, если говорить о самых маленьких геномах клеточных форм жизни (паразитических бактерий, таких как M. genitalium), но обычно ближе к 1 проценту или менее от общего числа генов (см. рис. 3-14).

2. Умеренно консервативная генная оболочка состоит из КОГ, представленных в самых разнообразных геномах, но не в подавляющем их большинстве. Недавний анализ имеющихся прокариотических геномов дает число КОГ оболочки около 5000. Гены оболочки составляют большую часть числа генов в любом геноме (см. рис. 3-14).

3. Малоконсервативное «облако» состоит из КОГ, встречающихся в узких группах организмов, и «генов-сирот» – генов в открытых рамках считывания (ОРС), обнаруженных пока что в одном-единственном геноме, но гомологи которых обычно обнаруживаются во вновь появляющихся геномных данных. Гены «облака» составляют переменную долю в каждом геноме, обычно в интервале 10–30 процентов от общего числа генов (см. рис. 3-14).

Примечательно, что эта структура является самоподобной, или фрактальной: те же три компонента – крошечное ядро, сравнительно большая оболочка и огромное «облако» – проявляются на любом уровне, где бы ни рассекалось генное пространство-время, от всего мира прокариот и до узких групп бактерий (см. рис. 3-14). Мы возвратимся к последствиям этой фрактальности геномного пространства-времени прокариот в главе 5. Заметим, однако, что эволюционная модель, которая объясняла бы наблюдаемую фрактальность, еще ожидает своей разработки[36].

Рис. 3-13 а. Глубокий уровень: 338 прокариот из базы данных EggNOG (Jensen et al., 2008)

Рис. 3-13 б. Средний уровень: 41 архей из базы данных arCOG (Makarova et al., 2007b)

Рис. 3-13 в. Мелкий уровень: 44 вида Escherichia, Shigella и Salmonella из базы данных COG (Tatusov et al., 2003). Регрессия данных экспоненциальными функциями на всех трех рисунках (Koonin and Wolf, 2008b) изображена пунктирными и непрерывными линиями.

Рис. 3-14. Вклад ядра, оболочки и «облака» в состав индивидуальных геномов и генной вселенной как целого. Расчет произведен по данным из базы EggNOG (Jensen et al., 2008). A. fulgidus – архея Archaeoglobus fulgidus; B. subtilis – бактерия Bacillus subtilis.

Следует обратить внимание на кажущийся парадокс в распределении КОГ в генном пространстве. Хотя в каждом геноме большинство генов относятся к оболочке, то есть являются общими с дальнородственными организмами, при рассмотрении всей генной вселенной оказывается, что гены (или, вернее, КОГ) ядра и оболочки составляют лишь незначительное меньшинство (см. рис. 3-14). Вполне очевидно, что эта разница возникает потому, что КОГ оболочки представлены во многих геномах, в то время как КОГ «облака», особенно «гены-сироты», являются редкими или уникальными. С учетом этой характерной структуры вселенной генов эволюционные реконструкции неизбежно приводят к картине динамичной эволюции генома, где многочисленные гены (в основном из «облака» и, в меньшей степени, из оболочки) утрачиваются, а многие другие приобретаются путем ГПГ (в основном у прокариот), а также в результате многочисленных дупликаций, в первую очередь у эукариот (см. ниже в этой главе).

Теперь, определив единицы геномной эволюции и разработав идею организации вселенной генов, мы можем осмысленно дополнить эти понятия списком основных операций, элементарных событий эволюции генома, которые можно будет сравнить с элементарными событиями эволюции отдельных генов. Алфавиты элементарных событий довольно кратки и фактически подобны (изоморфны) на соответствующих уровнях (см. табл. 3–3). Однако относительный вклад и частота различных типов событий разнятся в эволюции генов и геномов самым коренным образом. Существенное различие между эволюцией отдельных генов и целых геномов заключается в особой важности и высокой частоте дупликации генов, в отличие от много более ограниченного вклада внутригенных дупликаций. Далее, внутригенные рекомбинации редко закрепляются в эволюции, за исключением близких геномов, a важнейшие механизмы перестройки генома, такие как инверсии и транслокации, не играют особой роли в эволюции отдельных генов. В итоге различия в относительном вкладе разнообразных элементарных механизмов (см. табл. 3–2) лежат в основе значительно более динамичного характера эволюции геномов по сравнению с эволюцией отдельных генов.

Таблица 3–3. Сравнение элементарных событий эволюции гена и генома.

В предыдущей главе была подчеркнута относительная стабильность отдельных генов, составляющая яркий контраст динамизму геномной эволюции. Если гены или домены принять за атомарные единицы геномной эволюции, тогда геномы можно рассмотреть как статистические ансамбли таких единиц. Мы можем продолжить эту очень упрощенную, но очевидно не бессмысленную и потенциально продуктивную физическую аналогию и рассмотреть геномы как структуры, подобные газу или жидкости, в которых силы межмолекулярного взаимодействия хоть и являются важными параметрами, но слабы по сравнению с внутримолекулярными взаимодействиями (лежащими в основе стабильности молекул), в отличие от твердых тел, в которых межмолекулярные взаимодействия сильны и имеют определяющее значение.

Из статистической физики известно, что поведение ансамбля слабовзаимодействующих частиц (молекул) следует простым и универсальным статистическим закономерностям, таким как распределение Больцмана для скоростей частиц. Аналогия между ансамблями генов (геномами) и ансамблями молекул (газами и жидкостями) наталкивает нас на поиск статистических закономерностей в функционировании и эволюции генома. Более того, размышляя таким образом, мы можем с некоторой степенью уверенности предположить, что эти статистические закономерности должны представлять собой математически простые, универсальные законы распределения значений определенных параметров, описывающих процесс эволюции. Мы убедимся в этой главе, что поиск таких эволюционных универсалий – дело далеко не безнадежное.

Перед обсуждением статистических свойств генных ансамблей необходимо обратить внимание на еще одно ведущее направление биологических исследований первой декады третьего тысячелетия, представляющее собой новую область науки, часто называемую, может быть не очень удачно, системной биологией. Системная биология провозглашает своей конечной целью построение моделей и понимание функционирования биологических систем во всей их сложности. Реальное положение дел на данном этапе становления этой области исследований заключается в том, что основное внимание направлено на агрегацию обширных данных специфического типа, таких как транскриптомы (совокупность всех экспрессируемых РНК клетки, ткани или организма), протеомы (совокупность всех экспрессированных белков), метаболомы (совокупность всех метаболитов) и другие «-омы» (Bruggeman and Westerhoff, 2007; Koonin and Wolf, 2008a). Все эти «-омы» описываются системной биологией с помощью количественных понятий, таких как концентрация белка или метаболита.

Так же как и генетику в ее первые годы, системную биологию многие ученые приняли за скучную «большую науку» и слишком хлопотливое занятие. (Подозреваю, что это отношение до сих пор преобладает.) Так же как и с генетикой, первый взгляд оказался, мягко говоря, недальновидным. Наличие высококачественных данных по генной экспрессии, генетическим и белок-белковым взаимодействиям, локализации белка в клетке и других данных системного уровня в масштабе генома открыло новые измерения эволюционного анализа (иначе иногда называемого эволюционной системной биологией) и обеспечило его взаимопроникновение с эволюционной геномикой. В исследованиях системной биологии, в масштабах генома, уже были открыты нетривиальные связи между эволюцией генных последовательностей, генной экспрессией, структурой белка и другими характеристиками генов и белков. Эти открытия в целом оказались совместимыми с точкой зрения на геном как на статистический ансамбль генов и дали возможность в новом свете рассмотреть селективную и нейтральную составляющие эволюции структуры и функций генома.

Взаимосвязь между эволюционными и фенотипическими параметрами, универсалии эволюции генов, белков и геномов и физическая модель эволюционного процесса

В предыдущей главе было показано, что белок-кодирующие гены (по крайней мере в отношении мутационных замен, приводящих к изменению аминокислот в кодируемом белке) принадлежат к числу наиболее консервативных последовательностей генома. Однако уже на раннем этапе исследований в молекулярной эволюции стало понятно, что скорости эволюционирования белок-кодирующих генов могут очень сильно разниться (Wilson et al., 1977). Этот широкий разброс значений в общем объясняли существованием широкого спектра функций белка, которые по-разному ограничивают скорость эволюции соответствующих генов. В самом деле, кажется само собой разумеющимся, что огромная роль ДНК-полимеразы, сложнейшего фермента, который катализирует встраивание комплементарных матрице нуклеотидов в растущую цепь ДНК, требует значительного ограничения на скорость эволюции для соответствующей ей генной последовательности, в то время как, например, для структурного белка, чья единственная задача состоит в поддержании целостности ядерного матрикса, такого сильного ограничения не требуется. Фундаментальное представление о том, что эволюция белок-кодирующих генов может сводиться не только к уникальным особенностям молекулярной структуры и функции белков, возникло уже на этом раннем этапе. В богатой идеями обзорной статье, опубликованной Аланом Вильсоном и коллегами в 1977 году, выдвигается гипотеза о том, что скорость эволюции генных последовательностей зависит как от уникальных функций кодируемого белка, так и от важности этого белка для выживания организма (Wilson et al., 1977). Однако в то время не было прямых способов изучения эволюционных ограничений, так что эти идеи, хоть и интригующие, тогда находились всецело в области умозрительных построений.

В начале третьего тысячелетия геномика и системная биология полностью преобразили область эволюционных исследований. Доступность множества данных по геномным последовательностям позволила проанализировать и сравнить распределения скоростей эволюции для полных наборов ортологичных генов в различных таксонах, а также изучить взаимосвязи скоростей эволюции ортологов в различных эволюционных линиях. Значения скоростей эволюции по несинонимичным сайтам в ортологичных генах могут различаться на три-четыре порядка, и это распределение значений гораздо шире, чем распределение скоростей по синонимичным сайтам.