Хотелось бы отдельно остановиться она роли PCNA в процессах репарации.

Как уже говорилось, у высших эукариот эксцизионная репарация оснований протекает двумя альтернативными путями – с коротким и длинным ресинтезируемыми фрагментами. Их еще иногда называют ДНК-полимераза-?-зависимый и PCNA-зависимый пути.

PCNA-зависимый путь репарации АР-сайтов был совсем недавно реконструирован in vitro с участием АР-эндонуклеазы (АРЕ1), RFC, PCNA, FEN1, ДНК-полимеразы– ? и ДНК-лигазы I. При репарационной реакции в этой реконструированной системе преимущественно замещаются два нуклеотида. PCNA является обязательным участником этой системы и подавление его активности специфическими антителами приводит к ингибированию репарации АР-сайтов в клеточных экстрактах млекопитающих.

У дрожжей показано, что некоторые мутации в гене PCNA приводят к резкому снижению репарации после действия MMS (метил-метан-сульфоната, очень сильного мутагена), не затрагивая при этом их ростовой активности. К настоящему времени сложилось представление, что у дрожжей все пути BER PCNA-завимые.

Таким образом, pol? в процессе BER принимает участие и в PCNA-зависимом и в PCNA-независимом (pol?—завимом) путях. PCNA-зависимых путей тоже 2 – в первом из них вставляется 2 нуклеотида, а в другом – около 10–12 нуклеотидов. Может быть, это связано с тем, какая из полимераз – ? или ? будут использованы при этом, но прямых данных об этом нет, так как в системе in vitro замена одной на другую на уровень репарации не влияла.

Установлено, что PCNA может напрямую взаимодействовать с большой субъединицей RFC (состоящего из 5 субъединиц), экзонуклеазой FEN1, ДНК-полимеразой-? (третья субъединица) и ДНК-лигазой I. Это взаимодействие происходит благодаря наличию во всех этих белках консервативного мотива QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y), содержащего 8 аминокислотных остатков. Наличие этого мотива в различных белках представлено на рис. 7. PCNA служит молекулярным адаптером для привлечения всех этих белков в зону репаративной реакции. Данный мотив был обнаружен и у достаточно большого числа других белков – MSH2, MLH1 (белков, участвующих в эксцизионной репарации неспаренных оснований, MMR), р21, GADD45, циклина D, ДНК-цитозин-5-метил-трансферазы (MCMT), эндонуклеазы XPG. Для р21 опубликовано очень подробное описание его взаимодействия с PCNA, включающее вовлечение в этот процесс вторичной структуры белков.

На той же модели было показано, что эффективность репарации резко падает при использования в экспериментальной системе in vitro мутантных форм FEN1 и лигазы I, у которых не нарушена ферментативная активность, а только поврежден сайт их связывания с PCNA.

Рисунок 7. Белки, имеющие сайт QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y) для связывания с PCNA

Остается неясным, как все эти молекулы с PCNA-связывающим мотивом умудряются связаться с PCNA одновременно – ведь PCNA является гомотримером и может быть одновременно связан по данному мотиву не более, чем с тремя белками, а таких белков описано уже как минимум 15. Можно предположить, что в системе BER PCNA преимущественно связан с ДНК-полимеразой-?(?), FEN1 и лигазой I. Связывание же со всеми остальными белками, вероятнее всего, зависит от места и времени протекания реакции, в которую вовлечен PCNА и данные белки.

Тот же самый PCNA-связывающий мотив найден и в двух недавно описанных человеческих гликозилазах UNG2 и MYH1. Главными субстратами для этих гликозилаз служат некорректно встраивающиеся в процессе репликации урацил напротив аденина и аденин напротив 8-оксигуанина соответственно. UNG2 содержит PCNA-связывающий мотив в своей N-концевой части и является основной ДНК-урацил-гликозилазой человека. Напротив, N-конец UNG1, митохондриальной формы урацил-гликозилазы, содержит сигнал, указывающий на ее митохондриальную локализацию, но не PCNA-связывающий мотив. MYH является гомологом MutY E.coli, все ее формы несут PCNA-связывающий мотив в своем С-конце, вне зависимости от наличия у них сигнала митохондриальной локализации.

Предложено два объяснения возможного механизма, при котором эти две гликозилазы связываются с PCNA. Первое – обе эти гликозилазы могут преимущественно привлекать PCNА в район АР-сайта после выщепления неправильного основания, и таким образом направлять реакцию репарации по ее PCNA-зависимой ветви. Вторая возможность состоит в том, что UNG2 и MYH благодаря связыванию с PCNA могут ассоциироваться с «машиной репликации». Недавние исследования показали, что UNG2 может связываться с «машиной репликации» и через PCNA и через RPA (replication protein A, эукариотический гомолог белка SSB прокариот, состоящий из 3 субъединиц). Это больше подходит ко второму объяснению, но не отбрасывает и первого.

Урацил, являющийся субстратом UNG2, может попадать в ДНК двумя путями – при встраивании урацил-трифосфата во время репликации и дезаминировании уже встроенного цитозина. В первом случае, вновь встроенный урацил спаривается с аденином, и частота этого встраивания зависит от размера пула предшественника. Впрочем, надо помнить, что предшественник урацила совершенно «легально» постоянно присутствует в клетке и его уровень регулируется физиологическими механизмами. Во втором случае урацил оказывается спаренным с гуанином, причем 100–500 таких пар образуется в человеческой клетке ежедневно. UNG2 способна удалять урацил из обоих положений, две другие гликозилазы TDG и MED1 (MBD4) – только во втором случае (U/G). То есть урацил, встроившийся в процессе репликации может быть удален только UNG2, а урацил, появившийся в результате дезаминирования цитозина может быть убран тремя независимыми гликозилазами.

Похожая картина и с MYH1. Основной ее мишенью является аденин напротив 8-оксигуанина. Эта неправильная пара также образуется именно в процессе репликации ДНК. Здесь нужно отметить, что полимеразы ? и ? обычно вставляют именно аденин напротив 8-оксигуанина, а полимераза ? – цитозин. Связывание MYH1 с PCNA может облегчать репарацию неправильного спаривания, возникшую в процессе репликации. Другая гликозилаза – OGG1 (FPG E.coli) способствует выщеплению 8-оксоG, который возникает при прямом окислении двунитевой ДНК, напротив цитозина, но не напротив аденина. OGG1 не несет PCNA-связывающего мотива и не нуждается в его помощи для выщепления 8-оксоG. Хотя пока нет точных экспериментальных подтверждений того, что MYH1 связывается с PCNA или с «машиной репликации», но аналогия с UNG2 напрашивается сама собой. Гликозилазы, несущие PCNA-связывающий мотив участвуют в репарации повреждений, возникающих именно в процессе репликации, в отличие от тех гликозилаз, которые подобные повреждения репарировать не способны.

Рисунок 8. Схема репарации, спаренной с репликацией.

Таким образом две эти гликозилазы служат для специфической репарации, спаренной с репликацией, путем прямого связывания с репликационной машиной через PCNA. Схема этого процесса оитображена на рис. 8.

Остается нерешенным еще один вопрос – как эти две гликозилазы участвуют в репарации АР-сайтов. После действия UNG2 может включаться как PCNA-зависимый так и pol? зависимый процесс, так что тут все более-менее ясно. А вот MYH отличается тем, что не может использовать PCNA-зависимый путь, при котором синтез ведет pol?, так как pol? обязательно снова вставит аденин напротив 8-оксоG, и нарушение ДНК будет самовоспроизводиться в процессе репарации. Для репаративного синтеза может быть использован только pol?-зависимый путь, так как только pol? вставит напротив 8-оксоG цитозин

5.2. Эксцизионная репарация неспаренных оснований (mismatch repair, MMR)